Возрождение Державы - Куликов А.М. "ГМО и риски их использования"

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии Наук, Москва

Биотехнологические проекты давно перешагнули из области научного знания в область промышленно-коммерческого использования. Научно-технический прогресс нашел применение результатам фундаментальных биологических и молекулярно-биологических исследований в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и фармацевтике, медицине и приборостроении. Особенно широко в последнее время эксплуатируются достижения генетики и молекулярной биологии в сфере производства новых сортов сельскохозяйственных растений и пород животных, обладающих разнообразными новыми признаками, отсутствовавшими у родительских видов/сортов. Быстрое и массовое производство таких сортов, легкость и научная предсказуемость приобретения ими заданных свойств привели к их широкому использованию. Так в настоящий момент посевы ГМО (генетически модифицированных организмов) во всем мире занимают площади более 67.7 млн. гектар. И, вместе с тем, в последние годы резко обозначился вопрос – насколько безопасны данные технологии, насколько адекватно соблюдаются Международные руководящие принципы техники безопасности ЮНЕП в области биотехнолгии, принятые еще в 1995 г.

Аргументы сторонников соблюдения принципов предосторожности заставляют в настоящий момент правительства многих стран Европейского союза, Азии и Африки вносить корективы в сельскохозяйственную политику и отказываться от производства ряда сортов ГМО. В мировой литературе развернулась острая дискуссия об обоснованности декларируемых рисков применения ГМО. Многие аргументы сторонников соблюдения принципов предосторожности получили экспериментальное подтверждение (см. обзоры М.С.Соколова с соавт. (1), М Джованнетти (2)) Цель настоящего обзора – попытаться дать объективную оценку в первую очередь пищевых рисков.

Встраивание в геном организма-хозяина новых конструкций имеет цель получить новый признак, недостижимый для данного организма путем селекции или требующий годы работы селекционеров. Но вместе с приобретением такого признака организм приобретает целый набор новых качеств, опосредованных как плейотропным действием нового белка, так и свойствами самой встроенной конструкции, в том числе ее нестабильностью и регуляторным действием на соседние гены. Все нежелательные явления и события, происходящие при возделывании и потреблении ГМО, можно объединить в три группы: пищевые, экологические и агротехнические риски.

1. Непосредственное действие токсичных и аллергенных трансгенных белков ГМО.

2. Риски, опосредованные плейотропным действием трансгенных белков на метаболизм растений.

3. Риски, опосредованные накоплением гербицидов и их метаболитов в устойчивых сортах и видах сельскохозяйственных растений.

4. Риски горизонтального переноса трансгенных конструкций, в первую очередь в геном симбионтных для человека и животных бактерий (E.coli, Lactobacillus (acidophillus, bifidus, bulgaricus, caucasicus), Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium и др.).

1. Снижение сортового разнообразия сельскохозяйственных культур вследствии массового применения ГМО, полученных из ограниченного набора родительских сортов.

2. Неконтролируемый перенос конструкций, особенно определяющих различные типы устойчивости к пестицидам, вредителям и болезням растений, вследствии переопыления с дикорастущими родственными и предковыми видами. В связи с этим снижение биоразнообразия дикорастущих предковых форм культурных растений и формирование «суперсорняков».

3. Риски неконтролируемого горизонтального переноса конструкций в ризосферную микрофлору.

4. Негативное влияние на биоразнообразие через поражение токсичными трансгенными белками нецелевых насекомых и почвенной микрофлоры и нарушении трофических цепей.

5. Риски быстрого появления устойчивости к используемым трансгенным токсинам у насекомых-фитофагов, бактерий, грибов и других вредителей, под действием отбора на признак устойчивости, высокоэффективного для этих организмов.

6. Риски появления новых, более патогенных штаммов фитовирусов, при взаимодействии фитовирусов с трансгенными конструкциями, проявляющими локальную нестабильность в геноме растения-хозяина и тем самым являющимися наиболее вероятной мишенью для рекомбинации с вирусной ДНК.

1. Риски непредсказуемых изменений нецелевых свойств и признаков модифицированных сортов, связанные с плейотропным действием введенного гена. Например, снижение устойчивости к патогенам при хранении и устойчивости к критическим температурам при вегетации у сортов, устойчивых к насекомым-вредителям.

2. Риски отсроченного изменения свойств, через несколько поколений, связанные с адаптацией нового гена генома и c проявлением как новых плейотропных свойств, так и изменением уже декларированных.

3. Неэффективность трансгенной устойчивости к вредителям через несколько лет массового использования данного сорта.

4. Возможность использования производителями терминальных технологий для монополизации производства семенного материала.

Риски, связанные с производством биотехнологической продукции, начали обсуждаться в научной литературе с 1983 г. (3, 4). К середине 80-х г. в развитых странах вырабатывается государственная политика по биотехнологии. Так, например, в США контроль за использованием ГМО находится в юрисдикции трех агентств, американского Агентства по охране окружающей среды, американского Министерства сельского хозяйства, и американского Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Существует так же координационный комитет, осуществляющий согласованную работу всех трех ведомств по данному вопросу. Цели, задачи и законы, регламентирующие деятельность этого комитета, были опубликованы в 1986 г. (5).

Практические оценки влияния ГМО на организм при их пищевом потреблении появилсь недавно. Первые широкоизвестные работы по пищевым рискам ГМО принадлежат А.Пуштаи, работавшему в Исследовательском Институте Рауэтт, Великобритания (6–8) и стали предметом широко известной дискуссии 1999–2000 гг.

Однако возможность формирования выраженного иммунного ответа на трансгенный белок, являющийся аллергеном и потребляемый в составе растительного продукта, были известны и ранее. Например, за три года до начала этой дискуссии, Х.С.Мэйсон с соавт. показали высокий иммунный ответ у мышей на трансгенный картофель, модифицированный капсидным вирусным белком (9). Поскольку работа была посвященна модели оральной иммунизации животных белками, продуцируемыми в трансгенных системах, результаты этой и подобных работ остались незамеченными для диетологов и аллергологов. Тем не менее, работы, посвященные механизмам иммунного ответа человека на лектины, в частности хлебного дерева и сои, связывающихся с иммуноглобулином IgA1 (10) и приводящим к слипанию эритроцитов (11), были хорошо известны.

А.Пуштаи показал влияние трансгенного картофеля, модифицированного лектином подснежника, на гистологическом уровне – на состояние слизистой оболочки кишечника, частичную атрофию печени и изменение тимуса, и на физиологическом – на относительный вес внутренних органов крыс, содержащихся 9 месяцев на соответствующей диете, по сравнению с контрольными, питавшимися нетрансформированным картофелем. На страницах «BINAS News» опубликована полемика 1999 года, как критика и опровержение результатов А.Пуштаи, например, Д.Гейтхаусом, Ф.Дали, Р.Д.Брауном, так и позиция сторонников точки зрения А.Пуштаи, Б.Мифлина, Ж.Рифкина и др. (12). Тогда-же Е.Дришш и Т.Бег-Хансен публикуют меморандум, поддержавший А.Пуштаи и основанный на экспертной оценке его результатов группой из 20-ти (помимо авторов меморандума) ученых. Собственно, результаты Пуштаи были представлены в научной прессе после проведения экспериментов и подтверждения заявленных результатов сотрудником Абердинского Университета, С.В.Ивеном (5,7).

Позднее появляются работы, проведенные на культурах клеток крови человека и колоректальной карциномы, подтверждающие результаты А.Пуштаи (13, 14), начинают разрабатываться методики, посвященные оценке пищевых рисков, связанных с действием потенциальных аллергенов (15, 16). В обзорах по применению ГМО, авторы, в том числе и первоначально критиковавшие А.Пуштаи, указывают на необходимость строгой оценки пищевых и экологических рисков (17, 18).

Показательна история с сортом кукурузы StarLink®, скандал вокруг которой разгорелся в 2000–2001 гг. Эта кукуруза, трансформированная белком-токсином Bacillus thuringiensis Cry9C, был разрешен американским Агентством по охране окружающей среды к использованию с ограничениями, как кормовая культура в 1998 г. Ограничение в использовании было вызвано результатами тестирования белка Cry9C на устойчивость к перевариванию пепсином и к нагреванию, показавшими устойчивость выше минимально допустимой (19). В результате неконтролируемого переопыления с пищевыми сортами, урожай из гибридных растений был использован для получения пищевых продуктов. В 2000 г. фирма «Авентис» предоставила материалы, подтверждающие возможность использования сорта StarLink® в пищевых целях (20). Данные экспериментов по оценке токсичности и аллергенности модифицированного продукта всего на 10 крысах, якобы свидетельствали о его безопасности. В пользу своей точки зрения «Авентис» указывала на 30-летний опыт применения белка Cry9C в США в качестве инсектецида, и отсутствие данных в научной литературе по токсичному и аллергенному действию белка Cry9C. Ряд публикаций, посвященных оценке аллергенности и других возможных воздействий на организм подопытных животных белками Cry9C и родственного ему Cry1Ab, показали отсутствие патогенного действия данных белков в составе ГМО (21–23). Тем не менее, существующие данные по аллергенности токсинов B. thuringiensis (24) заставили провести дополнительные исследования аллергенности Cry–белков. Были получены данные, свидетельствующие о выработке антител и, соответственно, формировании аллергичной реакции на белок Cry1Ac (25), и ограниченности методов определения иммунных реакций (26), в частности теста ELISA, не способного оценивать аллергенность гликозилированных эпитопов белков (27). Гликозилирование – особенность многих аллергенов пищи (28), и известно, что Cry-белки имеют потенциально гликозилируемые участки (29), и взаимодействуют с мембранными аминопептидазами, что свидетельствует о наличие у Cry-белков гликозил-фосфатидилинозитольного мембранного якоря (30). Эти данные подтверждают первоначально осторожную оценку в применимости сорта StarLink® (19, 31) и оправдывают постоянно ведущийся в США мониторинг сортов кукурузы и производимых из них пищевых продуктов на присутствие белка Cry9C (32).

3. Свойства белков, обладающих бактерицидной, фунгицидной и инсектицидной активностью, используемых для трансформации сортов сельскохозяйственных растений

Как правило, токсичным или аллергеным действием обладают трансгенные белки, обеспечивающие устойчивость растений-реципиентов к поражению различными видами насекомых, грибковым и бактериальным заболеваниям. Устойчивость обеспечивается действием белков, обладающих набором специфициских свойств. Среди них:

• ферментативная активность к наиболее мажорным компонентам клеточной стенки целевых организмов (например, хитиназы для насекомых и грибов),

• лектиновая активность (лектины и арселины), опосредующая связывание с определенными рецепторам и мембранными гликопротеинами и реакции гликозилирования и приводящая к слипанию клеток желудочно-кишечного тракта и нарушению работы пищеварительных ферментов насекомых – вредителей,

• ингибирование рибосомальных белков (RIPs-белки), приводящее к нарушению синтеза новых белков клетками, контактирущими с RIPs,

• ингибирование функций пищеварительных протеаз и амилаз целевых организмов,

• формирование сквозных каналов в клеточной мембране (Cry- протоксины Bacillus thuringiensis, активизирующиеся после протеолитического расщепления), приводящее к лизису атакованных данными полипептидами клеток,

• проникновение в виде фрагментов исходного белка через стенки кишечника и связывание с ганглиозидами клеточных мембран (растительные протоксины: уреазы и канатоксины), что приводит к экзоцитозу клеток различных типов, разрушению кровяных пластинок и сопровождается гибелью целевого организма.

Табл.1 Действие некоторых растительных и бактериальных токсинов на целевые организмы и человека (19–30, 33–72).

Белок				Целевые организмы (семейства)			Действие на млекопитающих
Lectins	Man		Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Hymenoptera			Противоречивые данные
	GlcNac	Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Diptera			Токсичен
	GalNac/Gal	Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Diptera			Токсичен
RIPs				Coleoptera, Bacteria, Fungus, Viruses			Токсичен
Arcelins				Coleoptera			Не изучен
Serine protease inhibitors				Coleoptera, Lepidoptera, Orthoptera, Hymenoptera			Токсичен
Cystein protease inhibitors				Coleoptera, Hemiptera			Нет эффекта
a-Amylase inhibitors				Coleoptera, Lepidoptera			Токсичен
Modified storage proteins				Coleoptera			Не изучен
Chitinase				Lepidoptera, Bacteria, Fungus			Аллерген
Ureases (including Canatoxin-like)				Coleoptera, Hemiptera			Противоречивые данные
Bt toxins				Coleoptera, Lepidoptera, Homoptera, Diptera, Hymenoptera			Противоречивые данные
Anionic peroxidase				Coleoptera, Lepidoptera, Hymenoptera			Лигнин-токсичные метаболиты

Устойчивость к патогенам и вредителям формируется благодаря экспрессии
генов этих белков под действием тканеспецифичных промоторов в целевых тканях и органах растения. В настоящий момент практически все перечисленные классы белков используются при создании коммерческих сортов пищевых и кормовых растений.

4. Свойства трансгенных белков, обладающих инсектицидной активностью.

Данные, приведенные в табл.1, свидетельствут о значительной токсичности или аллергенности представителей большинства указанных классов белков, при их введении перорально. Однако часть из них присутствует и в норме в различных видах употребляемой растительной продукции. Проявление токсичных свойств таких белков будет опосредовано тканевой спецификой их экспрессии и концентрацией самих белков или синтезируемых при их участии продуктов метаболизма, например, ферментов биосинтеза гликоалкалоидов (в частности, соланина) у пасленовых. Для оценки пищевых рисков при создании устойчивых к вредителям сортов необходимо определить
допустимую степень воздействия этих белков на организм, используя традиционные сорта пищевых культур – источников белков этих классов в качестве контроля. Так как число оцениваемых параметров потенциально очень велико, принципиальную роль в таких оценках играет информация о механизмах возможных влияний этих белков на человека и животных.

Уреазы редко используются для трансформации растений (32а), так как для млекопитающих хорошо известен токсичный эффект ряда белков этого класса, выраженый при инъекционном введении белка. Вообще все белки этого класса имеют сходный набор ферментативных и лектиновых функций (33, 34). Известно, что канатоксины и уреазы не стойки к кислой среде, и поэтому при попадании с пищей в пищеварительный тракт разрушаются еще в желудке (35). Белки переваривабтся в составе растительной ткани, где они содержатся в строго определенных количествах, причем все этапы созревания, транспортировки и запасания белка идут в соответствии с естественными программами регуляции функций клетки. Как ведут себя трансгенные белки с повышенной экспрессией, насколько они доступны действию желудочного сока в составе трансгенной растительной ткани, необходимо выяснять в каждом конкретном случае. Тем более, что значительное увеличение экспрессии уреазы в трансгенных растениях (за счет плейотропных эффектов – см. ниже) показано, например, для коммерциализируемого сорта сои 30-4-2, устойчивого к пестициду Раундап (36). Свидетельством важности проверки активности уреаз в трансгенных сортах являются также данные о снижении индекса перевариваемости корма бройлерными цыплятами при повышении активности соевых уреаз в нем, даже не смотря на снижение активности трипсинового ингибитора (37). Неясно также, как изменяется кругооборот азота в трансгенном растении и каковы последствия этих изменений для разных биоактивных метаболитов, так как механизмы индукции активности уреаз растений пока не выяснены (38).

Ингибиторы сериновых протеаз обладают множественными функциями. Выполняя у растений роль запасающих белков, белков-регуляторов апоптоза и внутриклеточного протеолиза, они дополнительно способны блокировать ферменты пищеварительного тракта насекомых, действуя как неспецифичные субстраты. Пищеварительные ферменты насекомых, в частности их функциональные домены, сохранили высокое структурное сходство с подобными ферментами позвоночных, в том числе и человека, что приводит к сходному действию на них используемых растительных белков-ингибиторов (33, 39–43). Длительное воздействие на крыс соевыми ингибиторами протеиназ, в качестве пищевой добавки, или муки сырой сои, приводило к гипертрофии и гиперплазии поджелудочной железы, вплоть до неопластических новообразований и карциномы. Термальная обработка белков и пищи предотвращает эти эффекты (44). Подобное действие ингибиторов эндопептидаз сои на поджелудочную железу отмечено и для человека (45).

Совершенно отсутствуют работы по трансгенным сортам, модифицированными ингибиторами протеаз, с проведенной оценкой пищевых рисков, связанных с употреблением сырой и переработанной продукцией. Тем более, что модификация подобными белками овощных культур, употребляемых в сыром виде, несет непосредственную опасность для потребителя. Здесь же следует отметить, что предлагается использовать в качестве трансгенных белков ингибиторы протеиназ млекопитающих, в частности белка-ингибитора бычьего трипсина, обладающего выраженным инсектицидным действием (46). Однако эффект длительного воздействия этих белков в составе трансгенной пищи вообще не изучен.

Ряд растительных ингибиторов альфа-амилазы формируют комплексы с ферментами слюнных и поджелудочной желез и достигают максимальной активности при температуре от 35 до 50оС (47, 48). Некоторые ингибиторы альфа-амилаз хорошо известны как сильные аллергены, например, тетрамерный ингибитор амилазы пшеницы (49). В работах, посвященных свойствам белков этого класса и их прикладному использованию (50, 51), перечислено значительное количество токсичных и аллергенных растительных ингибиторов альфа-амилазы и указана необходимость сторгих оценок их пищевых рисков.

Физиологическое действие арселинов на млекопитающих не изучено, но известно, что они близки по структуре и свойствам к фитогемагглютининовым лектинам и ингибиторам альфа-амилазы (52), что предполагает сходные пищевые риски.

RIP’s белки, или ингибиторы рибосомальных белков, имеют узкую видовую специфичность к различным рибосомальным белкам. Они удаляют консервативный аденин из 28S субъединицы РНК, что препятствует сборке рибосом и приводит к гибели клеток. В силу своей видовой специфичности можно подобрать белки, обладающими инсектицидными, фунгицидными или бактерицидными свойствами (53, 54). Растения, трансформированные такими белками под специфическими вирусными промоторами, устойчивы к вирусным инфекциям, супрессируя выработку вирусных белков в инфицированных клетках (55). Но не стоит забывать, что рицин, один из сильнейших ядов, относится именно к этой группе белков. Другой пример: циннамомин, формирующий устойчивость трансгенных растений к личинкам насекомых, специфичен к 28S РНК крысы (56). Поскольку инактивация рибосом происходит необратимо, даже слабая аффинность RIP’s к рибосомальным белкам млекопитающих будет приводить к эффекту накопления. Поэтому проверка безопасности таких белков, выделенных в составе экстракта из трансгенного растения, должна проводиться длительное время, в том числе и на культурах человеческих клеток (что не делается).

Лектины были одними из первых трансгенов при формировании устойчивости к насекомым. Связываясь с гликанами на поверхности клетки, они приводят к слипанию клеток и нарушению физиологических функций организма.

С этим свойством растительных лектинов связана 40-летняя история их применения в качестве цитотоксических препаратов при химиотерапии раковых заболеваний (57, 58). О формировании иммунного ответа на некоторые трансгенные лектины мы упомянули в разделе «история вопроса» (6–8, 10, 11). Высокие пищевые риски при использовании лектинов были подтверждены и в других исследованиях. Так, лектин нарцисса, обладающий ярко выраженными свойствами инсектицида, является мутагеном, причем наиболее сильное мутагенное действие показано на культурах лимфоцитов человеческих эмбрионов и из периферического кровотока детей раннего постнатального периода развития (59). Эти данные показывают опасность использования данного лектина и близких к нему в первую очередь для наиболее молодой части человеческой популяции.

Проводимые работы с трансгенными инсектицидными лектинами бразильского ореха Bertholletia excelsa были прекращены в связи с их высокой аллергенностью (60, 61). Хитин-связывающие лектины из проростков пшеницы и фасоли обладают огромным инсектицидным потенциалом, но при этом токсичны для млекопитающих. Поэтому первоначально полученные трансгенные сорта кукурузы с широким спектром устойчивости к вредителям оказалось невозможным использовать в пищевых целях (62).
Для трансформации растений ферментами, разрушающими мажорные компоненты клеточной стенки вредителей, обычно хитина, используют растительные хитиназы, и хитиназы бактерий и насекомых (62, 63). Трансгенные конструкции на основе хитиназ сейчас очень популярны: хитиназами модифицированы различные сорта риса (64–66), картофеля (67, 68), пшеницы (69) и других культур. В то же время хорошо известны так называемые «латексные» или «банановые» аллергии, главным аллергеном в которых выступают хитиназы авокадо, бананов, каштана (70, 71). Хотя показана высокая аллергенность только хитиназ 1-го класса, возможная модификация трансгенного белка и близость структур хитиназ разных классов требует тщательной проверки на аллергенность всех трансгенных по хитиназам сортов (что не сделано).
Устойчивость к болезням может также индуцироваться не только белками, но и продуктами обмена веществ – вторичными метаболитами. Сорта кукурузы, табака и томатов с увеличенной экспрессией кислых пероксидаз вырабатывают в листьях повышенное содержание лигнина, препятствующего поражению растений насекомыми-вредителями (72). Продуктами разложения лигнина являются токсичные и мутагенные фенолы и метанол. Поэтому увеличение содержания лигнина в силосной массе, плодах или листьях табака представляет прямую опасность. Картофель, устойчивый к ряду болезней, модифицированный пероксидазой и кислой хитиназой, помимо лигнина содержит сублетальное (для растения) количество перекисных радикалов (68). При этом не изучено, как будут модифицироваться в этих условиях алкалоиды, которыми богаты пасленовые (см. Раздел «Плейотропные влияния трансгенных белков»).

В заключение этого раздела – об аллергиях. Аллергия на продукты питания – явление достаточно распространенное и неуклонно растущее среди населения развитых стран. Это связано, в первую очередь, с неблагоприятной экологической обстановкой, изменением традиционного рациона питания, к которому каждый народ адаптировался на протяжении многих веков, и современными технологиями пищевой промышленности, приводящими к повышенному содержанию в пище различных ксенобиотиков. И в этом смысле характеристикам трансгенных белков, обладающих инсектицидной активностью, необходимо уделить пристальное внимание, поскольку примерно половина патогенез-зависимых белков растений являются аллергенами (73). Повышение их содержания в устойчивых к заболеваниям сортов растений имеет прямой риск повышения аллергенности продуктов питания, изготовленных на основе этих сортов. Детские аллергии – экссудативный диатез и нейродермит, вообще имеют особый статус в аллергологии. Иммунная система человека окончательно формируется только к 12–14 годам, а кишечная флора, адаптированная к «взрослой» пище – к 3-м годам. Слизистая оболочка пищеварительного тракта ребенка обладает повышенной проницаемостью, как для питательных веществ, так и для патогенов. Это компенсируется высоким содержанием разнообразных иммуноглобулинов и лимфоцитов в крови и слизистой оболочке кишечника ребенка. Детский организм остро реагирует на «чужие» белки, к которым он не адаптирован, отсюда – особенно высокая чувствительность к аллергенам. Исходя из многочисленных наблюдений, фармакологи рекомендовали полностью исключить ГМО из состава детского питания (74). Начиная с 2004 года в странах Европейского Союза использование ГМО в продуктах детского питания, предназначенного для детей до 4-х лет, полностью запрещено.

5. Пищевые риски, связанные с устойчивостью ГМО к гербицидам.

Устойчивость возделываемых сортов к действию пестицидов дает большой экономический эффект – ручная или машинная прополка заменяется быстрой и сравнительно дешевой обработкой пестицидами, приводящей к гибели сорняков. Эта практика ведет к увеличению масштабов использщования гербицидов, и, соотвественно их воздействия на окружающую среду, а также вызввает быстрый отбор видов-сорняков, обладжющих повышенной устойчивостью к применяемым пестицидам (1, 75).

Для придания растению повышенной устойчивости к такому распространенному гербициду, как глифосат, используют конструкции на основе одного из двух генов: EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) и GOX (глифосат оксидоредуктаза). Сами по себе эти белки не являются ни аллергенами, ни токсинами.

Для оценки безопасности пищевого примения таких сортов, необходимо знать: какова способность таких сортов к накоплению ядовитых для человека и животных инсектицидов, и не происходит ли накопления других ядовитых метаболитов или аллергенов под действием плейотропных эффектов трансгенных конструкций. Следует иметь ввиду, что практически все пестициды токсичны для человека. Глифосат, например, является канцерогеном, вызывая лимфому (76). Обычно в работах, посвященных получению устойчивых к гербицидам сортов и их свойствам, указывают на отсутствие негативных свойств, подтвержденных многочисленными проверками (77). Действительно, исходя из правил получения и дальнейшей валидации трансгенной культуры, оцениваюся перевариваемость белков и состав метаболитов нового сорта, учитывается количество встроенных конструкций и нецелевые изменения свойств сорта, отбираются только стабильные трансформанты. Сотрудниками фирмы «Монсанто» было показано, например, хорошее соответствие состава модифицированной сои, устойчивой к глифосату, и родительского традиционного сорта (78). Но в литературе имеются данные, что при обработке глифосатом устойчивых к нему сортов сахарной свеклы, растения накапливают токсичные метаболиты глифосата (79). Более того, показана способность репродуктивных тканей (!) хлопчатника, устойчивого к глифосату, к очень высокому накоплению этого гербицида – от 0,14 до 0,48 мг/г (80). Это чрезвычайно важно, так как такие дозы при употреблении в пищу будут смертельными (допустимые дозы остаточного глифосата и его токсичных метаболитов в пищевых продуктах в США – 0,02 мг/кг сухого вещества). К сожалению, информация по анализу остаточных концентраций гербицидов в устойчивых сортах в сопровождающих документах и описаниях отсутствует. Насколько широко распространено это свойство устойчивых к глифосату сортов, какова тканевая специфичность накопления глифосата – неизвестно.

Другим эффективным и распространенным гербицидом является атразин.

Устойчивость картофеля и табака к его действию обеспечивается встраиванием в геном цитохрома CYP1A1, представителя класса P450 цитохромов (81, 82). Вместе с тем, известно немало работ, посвященных канцерогенным, иммунотоксичным и эмбриотоксичным свойствам этого вещества (например 83, 84). И в этом случае вопрос о накоплении этого гербицида в устойчивых к нему сортах не привлекает внимания разработчиков. А пищевой риск такого накопления огромен.

Риски, связанные с плейотропными влияниями трансгенных белков и конструкций, определяющих устойчивость к гербицидам, мы рассмотрим в следующем разделе.

6. Модификация метаболизма и плейотропные влияния трансгенных белков.

Пищевые риски могут быть связаны с действием плейотропных эффектов как самих трансгенных белков, так и регуляторным действием встроенных конструкций. Выше уже упоминалось усиление активности уреаз в трансгенном сорте сои, устойчивой к гербициду раундап (36). Несмотря на правила валидации трансгенных сортов, обнаружить нецелевые изменения метаболизма, активности различных белков, включая лектины и фитогормоны, не просто – исследователь не знает точно, что проверять. Изменения могут быть не количественными, а качественными, например, состава минорных фракций гликоалкалоидов, которые совместно могут обладать многократным синергетическим усилением мембранолитической активности. Существуют ли объективные основания для таких опасений? С конца 90-х годов проводилость изучение биосинтеза флавоноидов, природных антиоксидантов, участвующих в защите тканей растения от негативных последствий фотохимических
реакций, на модели трансгенных растений (85). В настоящий момент существуют трансгенные сорта помидоров (86) и картофеля (87) с усиленной продукцией флавоноидов. Принято считать, что повышенное содержание флавоноидов на организм человека положительно. Но такое изменение метаболизма растений может приводить к росту пищевых рисков.

Так, масс-спектрофотометрический анализ трансгенного картофеля показал резкое изменение состава минорных фракций гликоалкалоидов (87). Для оценки пищевых рисков в таких случаях необходимо проведение долговременных тестов, которые пока не проводятся.

Проводя работы по созданию трансгенных растений с устойчивостью к стрессующим факторам и для увеличения урожайности, используют ключевой фермент синтеза полиаминов – аргинин декарбоксилазу (88). Результатом гиперэкспрессии этого фермента у трансгенных табака и риса является повышенное содержание агматина – его непосредственного метаболита, и в ряде случаев – рост концентрации вторичных метаболитов путрисцина, спермидина и спермина (88, 89). При этом как агматин, так и его производные, являются биологически активными веществами, способными взаимодействовать с адренэргическими, имидазолиновыми и глутаматными рецепторами, выступая для организма человека в роли как нейромедиаторов, так и активаторов митоза и способствуя опухолеобразованию (90, 91). Будучи небелковой природы, эти вещества легко усваиваются организмом. Адекватность используемых в настоящий момент тестов для проверки таких рисков сомнительна.

Не обойдены вниманием производителей и цитокинины – растительные гормоны, производные пурина. Сорта томатов, модифицированных генами изопентилтрансферазы и бактериальной фитоэнсинтазы, обладают повышенной продуктивностью (92, 93). Однако сложнейшая регуляторная сеть, включаемая действием цитокининов в организме растения и затрагивающая как метаболизм, так и разнообразные тканевые и ростовые процессы, только изучается (94), и предсказать все эффекты от такого рода изменений пока невозможно. Но показано, что содержание фитогормона зеатина пуринового ряда и его производных растет (94а). Известны сильнейшие эффекты этих гормонов на клетки человека и млекопитающих различных типов (95, 96), за счет модуляции Ras – опосредованных клеточных сигнальных каскадов (97), ацетилхолинэстеразной активности (98), активности пуринорецепторов (99). Пока допустимые безопасные концентрации используемых фитогормонов в растительных продуктах не будут определны, остается высоко веротяным пищевой риск с использованием этих технологий.
У сорта пшеницы, модифицированного кислой глюконазой и хитиназой, наблюдалась гиперэкспрессия специфицеской фенилаланин-аммоний лиазы и связанное с этим накопление салициловой кислоты, приводящее к некрозам растительной ткани (100). Сама салициловая кислота обладает массой полезных свойств, и в модифицированном виде хорошо известна как аспирин, вот только в качестве пищевой добавки к хлебу или макаронным изделиям она может не подойти.

7. Риски производства фармацевтических препаратов в ГМО.

В 2003 г. возник термин «Фармагеддон» (101). Основанием служит большое число сортов риса и кукурузы, разрабатываемых и культивируемых различными биотехнологическими компаниями, несущих биологически активные вещества, в том числе: вакцины, гормоны роста, факторы свертывания крови, индустриальные энзимы, человеческие антитела, контрацептивные белки, подавляющие иммунитет цитокины и вызывающие аборт препараты. Существуют (101, 102) следующие риски неконтролируемого использования такой продукции:

• угроза переопыления и неконтролируемого распространения таких сортов среди пищевых;

• риск неконтролируемого экспонирования пищевых вакцин беременным;

• распространение вакцин и биоактивных веществ, выделяющихся в естественных условиях из растительных остатков через почвенные и поверхностные воды.

При переносе пыльцы растений ветром или насекомыми на места произрастания других сортов этого же вида, а также при случайном смешивании сортового материала, образуются гибридные растения, несущие признаки обоих сортов. Пример с сортом кукурузы StarLink® – не единственное подтверждение реальности таких рисков. В Мексике и Гватемале дикорастущие виды кукурузы уже плотно насыщены трансгенными вставками, за счет переопыления с возделываемыми культурными сортами (1). В то же самое время, на рисовых полях Калифорнии среди пищевых сортов риса проводятся открытые полевые испытания сортов риса, несущего человеческие белки лактоферрин и лизозим, используемые в фармакологии при энзимотерапии. Американская компания «Эпицит» недавно сообщила о создании и испытаниях сорта кукурузы, вырабатывающего человеческие антитела на поверхностные белки спермы, с целью получения противозачаточных препаратов (102). Неконтролируемое переопыление такого сорта с пищевыми может привести к серьезным демографическим последствиям на территориях, где производится подобная продукция.

Неконтролируемое распространение вакцин в составе пищевых продуктов обладает не меньшим риском. В ходе эмбриогенеза формирующаяся иммунная система «учится» распознавать «свои» белки, не путая их в дальнейшим с «чужими». Белки, экспонируемые клеткам иммунной системы во время эмбриогенеза, запоминаются как «свои». Если белок вакцины в это время попадет в кровоток эмбриона, то родившийся ребенок не сможет вырабатывать иммунитет к данному заболеванию, всегда распознавая данную бактерию или вирус как «свой».

При сборе урожая любой пищевой культуры огромная масса растительных остатков – листвы, стеблей и корней, остается на полях. Вероятность прямого распространения в почвенных водах белков, входящих в состав растений, низка, хотя значительно выше вероятность горизонтального переноса трансгенных конструкций в почвенных и других бактерий (см. далее). Но, кроме этого, существует еще один аспект рисков – это неконтролируемая вакцинация птиц и млекопитающих, обитающих в данной местности. Если трансгенные вакцины направлены против бактерий и вирусов, имеющих местных животных в качестве переносчиков (или бактерий, родственных человеческим болезнетворным бактериям), то такая вакцинация спровоцирует мощный отбор среди патогенов и формирование суперинфекций.

8. Риски горизонтального переноса трансгенных конструкций.

Горизонтальный перенос генов широко известен в царстве бактерий. В ходе эволюции обмен генами осуществлялся как между ними, так и между бактериями и эукариотами. Способность обмениваться участками генома бактерии сохраняют до сих пор. И это свойство бактерий имее прямое отношение к экологическим и пищевым рискам испольгования ГМО. Нахождение в желудочно-кишечном тракте в составе пищи собственно ферментов, использующих антибиотик как субстрат, практически безопасно для человека и животных. Ферментам необходимы строго определенные условия для проявления активности, поэтому белки, осуществляющие внутриклеточный метаболизм, функционировать будут только в составе живой клетки.

Вероятность встраивания трансгенной конструкции из растения в геном млекопитающих и человека ничтожно мала. Следует учитывать, что клетки высших эукариот имеют несколько изолирующих барьеров, эффективно препятствующих горизонтальному переносу. Даже в случае такого переноса клетка, как правило не размножается, находясь в терминальной стадии дифференцировки. Перенос конструкции в половые клетки вообще невероятен, учитывая гемато-тестикулярный барьер, не проницаемый для крупных молекул. Но не следует забывать, что человек имеет эндосимбионтов, в частности, кишечную бактериальную флору. Известно, что бактерии способны к трансформации как кольцевыми, так и линейными формами ДНК с инвертированными повторами (103). Фрагменты трансгенной ДНК в содержимом кишечника, крови и молоке животных, питающихся ГМО (у коров – 104, у свиней – 105). При этом, в соответствии с часто применяемой методикой отбора трансгенных конструкций под действием антибиотиков, эти фрагменты несут репортерные гены устойчивости к антибиотикам в качестве маркерных последовательностей (77, 106). Эти гены могут быть как молчащими, так и нормально экспрессирующимися. В любом случае, трансформация ими симбионтных или патогенных бактерий может «включить» их уже в составе бактериального генома, например, путем рекомбинации и возникновения т.н. химерных белков, обладающих ферментативной активностью
по отношению к антибиотику. Это ведет к формированию устойчивости к антибиотикам или самих симбионтных бактерий, или патогенной флоры. Результатом использования антибиотика при заболевании будет быстрый отбор бактерий, устойчивых к нему, и антибиотик либо начнет перерабатываться непосредственно в кишечнике, не достигая целевых патогенных бактерий, либо не будет оказывать влияния на резистентные к нему патогены. Поскольку основные бактерии-симбионты живут в толстой кишке, риск метаболизма антибиотиков бактериями кишечной флоры касается, в основном, плохо всасывающихся антибиотиков, например неомицина и канамицина. Трансгенные конструкции, несущие в качестве маркерного признака устойчивость как раз к таким препаратам, и были широко использованы биотехнологическими компаниями.

Сценарии риска трансформации бактерий растительными конструкциями подвергались критике, например А.Л.Коновым (107), на основании экспериментальных данных, демонстрирующих низкую частоту передачи наследственного материала от ГМО-организмов болезнетворным бактериям.

Обратимся к цифрам и фактам. Порядок частот трансформации для разных штаммов бактерий при обнаружении трансформированных колоний составлял 10-4–10-8, при отсутствии таковых – не выше 10-16. Число симбионтных бактерий в одном грамме содержимого кишечника достигает 1011.При пересчете на общее содержимое кишечника это даст вполне высокую вероятность трансформации бактерий-симбионтов. Для Escherichia coli давно известно большое число патотипов, имеющих различия от нескольких до 1387 новых генов, расположенных в штамм-специфических кластерах и приобретенных в разное время путем горизонтального переноса (108, 109). То-есть, горизонтальный перенос генов для нее не исключительное событие. Что касается передачи устойчивости к антибиотикам между различными бактериями, то это вполне доказанное явление. Был показан перенос устойчивости к антибиотикам от патогенных Acinetobacter baumannii к E.coli и Proteus mirabilis (110). Действительно, эффективная бактериальная система переноса генов устойчивости к антибиотикам представлена IncQ-подобными плазмидами, передающимися между E.coli, Acinetobacter sp. и другими штаммами бактерий (111). И вероятность формирования рекомбинантных плазмид, несущих новые гены из конструкций, с новой устойчивостью к пока эффективным антибиотикам, пока никак не оценивалась.

В связи с изложенным выше материалом по свойствам белков с инсектицидной активностью возникает еще один риск – формирования новых патогенных штаммов E.coli. Показано, что широко используемый в трансгенных конструкциях 35S промотор вируса CaMV, контролирующий экспрессию целевого гена, распознается транскрипционным комплексом широкого спектра видов бактерий (112, 113). При этом велика вероятность получения химерных белков с непредсказуемыми свойствами. Какова специфичность экспрессии других используемых промоторов – предстоит оценить, и без такой оценки говорить о безопансости используемой ГМ-технологии.
В некоторых работах оценка рисков горизонтального переноса проводится на основе анализа методами ПЦР (полимеразной цепной реакции) мускулатуры животных, питающихся трансгенной растительной пищей (114). Очевидно, подобный подход совершенно не обоснован, и отсутствие маркеров конструкций в мускулатуре, вполе ожидаемое, никак не связано с реальными рисками горизонтального переноса.

Характеристики плейотропных влияний (или отсутствие таковых) встроенных генов и конструкций, проведенные с непосредствнно полученным сортом, должны меняться с течением времени. Это связано с нестабильностью ряда конструкций, способных к перемещению в геноме и амплификации с течением времени. Уже известны примеры по изменениям в геноме трансгенных растений, связанные с наличием «горячих точек» рекомбинации в конструкциях (115). Эти процессы резко снижают надежность и устойчивость однажды заявленных производителями свойств новых трансгенных сортов.

Критика метода отбора трансформированных культур по устойчивости к антибиотикам привела к тому, что использование репортерных генов устойчивости к антибиотикам запрещено для получения новых пищевых сортов, такие сорта изымаются из обращения. Тем не менее, во многих случаях использование плазмид, содержащих нетранскрибируемые копии генов устойчивости к антибиотикам продолжается. И продолжается использование таких запрещенных сортов: согласно сообщению Mr. Morley от 25 июня 2003 года в Английском парламенте, в Англии на полях с ГМО сортами растений были найдены сорта, несущие гены устойчивости к канамицину и неомицину, ампициллину и амоксициллину, и к гидромицину.(115а)

Отмеченные выше факты неблагоприятного воздействия трансгенов на организм человека и животных не свидетельствуют о порочности технологии создания ГМО как таковой. Мы обращаем внимание на актуальность проблемы анализа пищевых и прочих рисков использования ГМО, на необходимость выработки норм экспертизы и тестирования новых сортов, с учетом уже известных рисков и постоянному жесткому контролю ГМО по исходным, не модифицированным сортам. Безусловно, оценка таких рисков всегда будет относительна – любые употребляемые нами продукты питания способны осуществлять разнообразные воздействия на организм, а в процессе производства любой пищевой продукции происходит вмешательство человека в окружающую природу.

Имеющиеся данные, лишь часть которых была кратко описана в настоящем обзоре, показывают, что есть немало уже доказанных случаев реальных пищевых рисков, связанных с использованием генетически модифицированных организмиов по сравнению с исходными организмами. Однако в условиях монополизации и производства семенного материала, и его экспертизы одной или несколькими крупными биотехнологическими корпорациями трудно ожидать объективных оценок этих рисков. В результате, проблема «регуляции рисков» может превратиться в проблему «рисков регуляции» (116, 117).

1. Соколов М.С., Вельков В.В., Медвинский А.Б. 2002. Государственное регулирование трансгенных растений и оценка экологических рисков их производства.
В сб. «Обеспечение экологической безопасности при использовании генетически модифицированных организмов» , М., , сс.17–27.
2. Giovannetti M. 2003. The ecological risks of transgenic plants. Riv.?? Biol. vol. 96, #2, pp.207–223.
3. Miller H.I. 1983. Report on the World Health Organization Working Group on Health Implications of Biotechnology. Recomb. DNA Tech. Bull. , vol.6, #2 pp.65– 66.
4. Petricciani J.C. 1983. An overview of safety and regulatory aspects of the new biotechnology. Regul. Toxicol. Pharmacol. vol. 3 , #4, pp.428–433.
5. Office of Science and Technology Policy. 1986. Coordinated framework for regulation of biotechnology: announcement of policy and notice for public comment. U.S. Fed. Reg. Vol. 51, 23302–23350 .
6. Ewen S.W., Pusztai A. 1999. Effect of diets containing genetically modified potatoes expressing Galanthus nivalis lectin on rat small intestine. Lancet, vol. 354, # 9187, pp. 1353–1354.
7. Pusztai A, Bardocz G.G., Alonso R., Chrispeels MJ, Schroeder HE, Tabe LM, Higgins TJ. 1999 Expression of the insecticidal bean alpha-amylase inhibitor transgene has minimal detrimental effect on the nutritional value of peas fed to rats at 30% of the diet. J Nutr. vol.129, #8, pp.1597–1603.
8. Ewen SW, Pusztai A. 1999 Health risks of genetically modified foods. Lancet. vol. 354; #9179, p.684.
9. Mason HS, Ball JM, Shi JJ, Jiang X, Estes MK, Arntzen CJ. 1996 Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.93; #11, pp.5335–5340.
10. Skea DL, Christopoulous P, Plaut AG, Underdown BJ. 1988 Studies on the specificity of the IgA-binding lectin, jacalin. Mol Immunol. vol.25, #(1) pp.1–6.
11. Antoniuk VO. 1992 [Isolation of lectin from horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.) seeds and study of its interaction with carbohydrates and glycoproteins] Ukr Biokhim Zh. ;64(5):47–52.
12. BINAS Monitor, in BINAS News, 1999, vol.5, Iss.1&2, ,pp 12–19. http://binas.unido.org/ /binas/binasnews/bn1_2_99.pdf
13. Fenton B, Stanley K, Fenton S, Bolton-Smith C. 1999 Differential binding of the insecticidal lectin GNA to human blood cells. Lancet. ; vol.354, #9187:1354–1355.
14. Gabor F, Stangl M, Wirth M. 1998 Lectin-mediated bioadhesion: binding characteristics of plant lectins on the enterocyte-like cell lines Caco-2, HT-29 and HCT-8. J Control Release. vol;55, #2–3, pp:131–142.
15. Lauterslager TG, Florack DE, van der Wal TJ, Molthoff JW, Langeveld JP, Bosch D, Boersma WJ, Hilgers LA. 2001 Oral immunisation of naive and primed animals with transgenic potato tubers expressing LT-B. Vaccine. vol.19, #17–19, pp.2749–2755.
16. Dearman RJ, Caddick H, Stone S, Basketter DA, Kimber I. 2001 Characterization of antibody responses induced in rodents by exposure to food proteins: influence of route of exposure. Toxicology. vol.167, #3: pp.217–231.
17. Dale PJ. 1999 Public concerns over transgenic crops. Genome Res. vol.9, #12: pp.1159–1162.
18. Halford NG, Shewry PR. 2000 Genetically modified crops: methodology, benefits, regulation and public concerns. Br Med Bull.;vol.56, #1: pp.62–73.
19. U.S. Environmental Protection Agency. 1998 Bacillus thuringiensis subspecies tolworthi Cry9c protein and the genetic material necessary for its production in corn; exemption from the requirement of a tolerance. Fed Reg 63:28258–28261.
20. U.S. EPA. 2000 Assessment of Scientific Information Concerning StarLink Corn Cry9C Bt Corn Plant-Pesticide. Docket PF-867B. Arlington, VA:U.S. Environmental Protection Agency, Fed Reg:65:65245–65251 .
21. Okunuki H, Teshima R, Shigeta T, Sakushima J, Akiyama H, Goda Y, Toyoda M, Sawada J. 2002 Increased digestibility of two products in genetically modified food (CP4-EPSPS and Cry1Ab) after preheating. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. vol.43, #2: pp.68–73.
22. Teshima R, Watanabe T, Okunuki H, Isuzugawa K, Akiyama H, Onodera H, Imai T, Toyoda M, Sawada J. 2002 Effect of subchronic feeding of genetically modified corn (CBH351) on immune system in BN rats and B10A mice. Shokuhin Eiseigaku Zasshi. vol. 43, #5: pp.273–279.
23. Phipps RH, Deaville ER, Maddison BC. 2003 Detection of transgenic and endogenous plant DNA in rumen fluid, duodenal digesta, milk, blood, and feces of lactating dairy cows. J Dairy Sci. vol.86, #12: pp.4070–4078.
24. Bernstein IL, Bernstein JA, Miller M, Tierzieva S, Bernstein DI, Lummus Z, Selgrade MK, Doerfler DL, Seligy VL. 1999 Immune responses in farm workers after exposure to Bacillus thuringiensis pesticides. Environ Health Perspect. vol.107, #7:pp.575–582.
25. Vazquez-Padron RI, Moreno-Fierros L, Neri-Bazan L, Martinez-Gil AF, de-la-Riva GA, Lopez-Revilla R. 2000 Characterization of the mucosal and systemic immune response induced by Cry1Ac protein from Bacillus thuringiensis HD 73 in mice. Braz J Med Biol Res. vol. 33, #2: pp.147–155.
26. Bernstein JA, Bernstein IL, Bucchini L, Goldman LR, Hamilton RG, Lehrer S, Rubin C, Sampson HA. 2003 Clinical and laboratory investigation of allergy to genetically modified foods. Environ Health Perspect. vol.111, #8: pp.1114–1121.
27. Raybourne RB, Williams KM, Vogt R, Reissman DB, Winterton BS, Rubin C. 2003 Development and use of an ELISA test to detect IgE antibody to Cry9c following possible exposure to bioengineered corn. Int Arch Allergy Immunol. vol.132, #4: pp.322–328.
28. U.S. EPA. 2000 FIFRA Scientific Advisory Panel. Assessment of Scientific Information Concerning StarLink Corn. Arlington, VA:U.S. Environmental Protection Agency, 28 pp..
29. Oltean DI, Pullikuth AK, Lee HK, Gill SS. 1999 Partial purification and characterization of Bacillus thuringiensis Cry1A toxin receptor A from Heliothis virescens and cloning of the corresponding cDNA. Appl Environ Microbiol., vol.65, #11: pp.4760–4766.
30. Rajagopal R, Agrawal N, Selvapandiyan A, Sivakumar S, Ahmad S, Bhatnagar RK 2003 Recombinantly expressed isoenzymic aminopeptidases from Helicoverpa armigera (American cotton bollworm) midgut display differential interaction with closely related Bacillus thuringiensis insecticidal proteins. Biochem J. vol.370, Pt 3, :971–978.
31. Bucchini L, Goldman LR. 2002 Starlink corn: a risk analysis. Environ Health Perspect. vol,110, #1: pp.5–13.
32. Orlandi PA, Lampel KA, South PK, Assar SK, Carter L, Levy DD. 2002 Analysis of flour and food samples for cry9C from bioengineered corn. J Food Prot. vol. 65, #2:pp. 426–431.
32а. Brodzik, R., Koprowski, H., Yusibov, V. & Sirko, A. 2000 Production of urease from Helicobacter pylori in transgenic tobacco plants. Cell Mol.Biol. Lett. vol. 5, pp.357–366.
33. Carlini C.R., Grossi-de-Sá M.F. 2002 Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon vol..40, Is.11 ,, pp.1515–1539.
34. Follmer C, Barcellos GB, Zingali RB, Machado OL, Alves EW, Barja-Fidalgo C, Guimaraes JA, Carlini CR. 2001 Canatoxin, a toxic protein from jack beans (Canavalia ensiformis), is a variant form of urease (EC 3.5.1.5): biological effects of urease independent of its ureolytic activity. Biochem J. vol.360, Pt 1: pp.217–24.
35. Carlini CR, Guimaraes JA. 1991 Plant and microbial toxic proteins as hemilectins: emphasis on canatoxin. Toxicon.; vol.29, #7): pp.791–806.
36. Kawata M. 2001 Inspection of the Safety Assessment of Genetically Modified, the Roundup Tolerant Soybean: Monsanto’s Dangerous Logic as seen in the Application Document submitted to Japan, By Masaharu Kawata, Assistant Professor, School of Science, Nagoya University, Japan, 2001. in http://www.biotech-info.net/safety_inspection2.html
37. Navarro G.H., Lopez C.C., Garcia E., Forat S.M. 2001 Field Evaluation of a Fullfat Soybean Meal Obtained with the Use of an Expander in Commercial Broiler Rations. FE/SBM 107-2001 - E in http://www.asa-europe.org/online/Navarro_ExFFSBM.pdf
38. Witte CP, Tiller SA, Taylor MA, Davies HV. 2002 Leaf urea metabolism in potato. Urease activity profile and patterns of recovery and distribution of (15)N after foliar urea application in wild-type and urease-antisense transgenics. Plant Physiol. vol.128, #3: pp.1129–1136.
39. Holm H, Jorgensen A, Hanssen LE. 1991 Raw soy and purified proteinase inhibitors induce the appearance of inhibitor-resistant trypsin and chymotrypsin activities in Wistar rat duodenal juice. J Nutr. vol.121, #4: pp.532–538.
40. Struthers BJ, MacDonald JR. 1983 Comparative inhibition of trypsins from several species by soybean trypsin inhibitors. J Nutr. vol.113, #4: pp.800–804.
41. Reseland JE, Holm H, Jacobsen MB, Jenssen TG, Hanssen LE. 1996 Proteinase inhibitors induce selective stimulation of human trypsin and chymotrypsin secretion. J Nutr. vol.126, #3: pp.634–642.
42. Krogdahl A, Holm H. 1981 Soybean proteinase inhibitors and human proteolytic enzymes: selective inactivation of inhibitors by treatment with human gastric juice. J Nutr. vol.111, #12: pp.2045–2051.
43. Tan-Wilson AL, Wilson KA. 1986 Relevance of multiple soybean trypsin inhibitor forms to nutritional quality. Adv Exp Med Biol.;vol.199, pp.391–411.
44. Liener IE. 1995 Possible adverse effects of soybean anticarcinogens. J Nutr. vol.125 #3 Suppl: pp.744S–750S.
45. Liener IE, Goodale RL, Deshmukh A, Satterberg TL, Ward G, DiPietro CM, Bankey PE, Borner JW. 1988 Effect of a trypsin inhibitor from soybeans (Bowman-Birk) on the secretory activity of the human pancreas. Gastroenterology. vol.94, #2: pp.419–427.
46. Christeller JT, Burgess EP, Mett V, Gatehouse HS, Markwick NP, Murray C, Malone LA, Wright MA, Philip BA, Watt D, Gatehouse LN, Lovei GL, Shannon AL, Phung MM, Watson LM, Laing WA. 2002 The expression of a mammalian proteinase inhibitor, bovine spleen trypsin inhibitor in tobacco and its effects on Helicoverpa armigera larvae. Transgenic Res. vol.11, #2: pp.161–173.
47. Yoshikawa H, Kotaru M, Tanaka C, Ikeuchi T, Kawabata M. 1999 Characterization of kintoki bean (Phaseolus vulgaris) alpha-amylase inhibitor: inhibitory activities against human salivary and porcine pancreatic alpha-amylases and activity changes by proteolytic digestion. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). vol.45, #6: pp.797–802
48. Suehiro I, Otsuki M, Yamasaki T, Ohki A, Sakamoto C, Yuu H, Maeda M, Baba S. 1981 Effect of alpha-glucosidase inhibitor on human pancreatic and salivary alpha-amylase. Clin Chim Acta. vol.117, #2: pp.145–152.
49. Kusaba-Nakayama M, Ki M, Kawada E, Sato M, Ikeda I, Mochizuki T, Imaizumi K 2001. Intestinal absorbability of wheat allergens, subunits of a wheat alpha-amylase inhibitor, expressed by bacteria. Biosci Biotechnol Biochem. vol.65, #11: pp.2448–2455.
50. Svensson B., Fukuda K., Nielsen P.K., B��nsager B.C. 2004 Proteinaceous -amylase inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins & Proteomics, Volume 1696, Is.2, , pp. 145–156.
51. Franco O.L., Rigden D.J., Melo F.R., Grossi-de-S�� M.F. 2002 Plant -amylase inhibitors and their interaction with insect -amylases. Structure, function and potential for crop protection. Eur. J. Biochem., vol.269, #2, pp. 397–412.
52. Fabre C, Causse H, Mourey L, Koninkx J, Riviere M, Hendriks H, Puzo G, Samama JP, Rouge P. 1998 Characterization and sugar-binding properties of arcelin-1, an insecticidal lectin-like protein isolated from kidney bean (Phaseolus vulgaris L. cv. RAZ-2) seeds. Biochem J. vol.329, Pt 3: pp.551–560.
53. Park S-W., Stevens NM., Vivanco JM. 2002 Enzymatic specificity of three ribosome-inactivating proteins against fungal ribosomes, and correlation with antifungal activity. Planta. vol.216, #2: pp.227–234.
54. Nielsen K, Boston RS. 2001 RIBOSOME-INACTIVATING PROTEINS: A Plant Perspective. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. vol.52: pp.785–816.
55. Desmyter S, Vandenbussche F, Hao Q, Proost P, Peumans WJ, Van Damme EJ. 2003 Type-1 ribosome-inactivating protein from iris bulbs: a useful agronomic tool to engineer virus resistance? Plant Mol Biol. vol.51, #4: pp.567–576.
56. He WJ, Liu WY. 2003 Cinnamomin: a multifunctional type II ribosome-inactivating protein. Int J Biochem Cell Biol. vol.35, #7: pp.1021–1027.
57. Aub JC, Sanford BH, Cote MN. 1965 Studies on reactivity of tumor and normal cells to a wheat germ agglutinin. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.54, #2: pp.396–399.
58. Aub JC, Sanford BH, Wang LH. 1965 Reactions of normal and leukemic cell surfaces to a wheat germ agglutinin. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.54, #2: pp.400–402.
59. Summers C, Forrest J, Norval M, Michael Sharp J. 2002 The potentially insecticidal Narcissus pseudonarcissus lectin demonstrates age-related mitogenicity. FEMS Immunol Med Microbiol. vol.33, #1: pp.47–49.
60. Lehrer S.B. 2000 Potential health risks of genetically modified organisms: How can allergens be assessed and minimized. In: G.J. Persley and M.M. Lantin (Eds.), Agricultural Biotechnology and the Poor, Consultative Group on International Agricultural Research, Washington DC, USA, pp. 149–155.
61. Nordlee J.A., Taylor S.L., Townsend J.A., Thomas L.A., Bush R.K. 1996 Identification of Brazil nut allergen in transgenic soybeans. N. Engl. J. Med. vol.334, #11, pp. 666–692.
62. Hilder V.A., Boulter D. 1999 Genetic engineering of crop plants for insect resistance – a critical review, Crop Prot. vol.18, , pp.177–191.
63. Herrera-Estrella A, Chet I. 1999 Chitinases in biological control. EXS.; vol.87: pp.171–184.
64. Itoh Y, Takahashi K, Takizawa H, Nikaidou N, Tanaka H, Nishihashi H, Watanabe T, Nishizawa Y. 2003 Family 19 chitinase of Streptomyces griseus HUT6037 increases plant resistance to the fungal disease. Biosci Biotechnol Biochem. vol.67, #4: pp.847–855.
65. Datta K, Baisakh N, Thet KM, Tu J, Datta SK. 2002 Pyramiding transgenes for multiple resistance in rice against bacterial blight, yellow stem borer and sheath blight. Theor Appl Genet. vol.106, #1: pp.1–8..
66. Kim JK, Jang IC, Wu R, Zuo WN, Boston RS, Lee YH, Ahn IP, Nahm BH. 2003 Co-expression of a modified maize ribosome-inactivating protein and a rice basic chitinase gene in transgenic rice plants confers enhanced resistance to sheath blight. Transgenic Res. vol.12 #4: pp.475–484.
67. Esposito F, Fogliano V, Cardi T, Carputo D, Filippone E. 2002 Glycoalkaloid content and chemical composition of potatoes improved with nonconventional breeding approaches. J Agric Food Chem. ;vol.50 #6: pp.1553–1561.
68. Wu G, Shortt BJ, Lawrence EB, Leon J, Fitzsimmons KC, Levine EB, Raskin I, Shah DM. 1997 Activation of Host Defense Mechanisms by Elevated Production of H2O2 in Transgenic Plants. Plant Physiol. vol.115 #2: pp.427–435.
69. Anand A, Zhou T, Trick HN, Gill BS, Bockus WW, Muthukrishnan S. 2003 Greenhouse and field testing of transgenic wheat plants stably expressing genes for thaumatin-like protein, chitinase and glucanase against Fusarium graminearum. J Exp Bot. vol.54, #384: pp.1101–1111.
70. Palacios S. A. 2001 Latex allergy. Diagnosis and therapeutic aspects Allergol Immunopathol (Madr). vol.29, #5: pp.212–221.
71. Sussman GL, Beezhold DH, Kurup VP. 2002 Allergens and natural rubber proteins. J Allergy Clin Immunol. vol.110, #2 Suppl: pp.S33–S39.
72. Down P.F., Herms D.A., Berhof M.A., Lagrimini L.M. 2000 Mechanisms of insect resistence in transgenic plants (over)expressing a tobacco anionic peroxidase. Plant Peroxidase newsletter, is.14, pp. 93–101.
73. Hoffmann-Sommergruber K. 2002 Pathogenesis-related (PR)-proteins identified as allergens. Biochem Soc Trans. vol.30, Pt 6: pp.930–935.
74. Cantani A, Micera M. 2001 Genetically modified foods and children potential health risks. Eur Rev Med Pharmacol Sci. vol.5, #1: pp.25–29.
75. Wauchope RD, Estes TL, Allen R, Baker JL, Hornsby AG, Jones RL, Richards RP, Gustafson DI. 2002 Predicted impact of transgenic, herbicidetolerant corn on drinking water quality in vulnerable watersheds of the mid-western USA. Pest Manag Sci. vol.58, #2: pp.146–160.
76. Hardell L., Eriksson M. A 1999 Case-Control Study of Non-Hodgkin Lymphoma and Exposure to Pesticides, CANCER, vol.85, No.6, pр.1353–1360
77. Felsot A. 2000 Herbicide Tolerant Genes. Pt. 1: Squaring Up Roundup Ready Crops. Agrichemical and Environmental News, September, Is.173 (http://www.aenews.wsu.edu/ Sept00AENews/Sept00AENews.htm#anchor5301120)
78. Padgette SR, Taylor NB, Nida DL, Bailey MR, MacDonald J, Holden LR, Fuchs RL. 1996 The composition of glyphosate-tolerant soybean seeds is equivalent to that of conventional soybeans. J Nutr. vol.126, #3: pp.702–716.
79. Muller BP, Zumdick A, Schuphan I, Schmidt B. 2001 Metabolism of the herbicide glufosinate-ammonium in plant cell cultures of transgenic (rhizomania-resistant) and non-transgenic sugarbeet (Beta vulgaris), carrot (Daucus carota), purple foxglove (Digitalis purpurea) and thorn apple (Datura stramonium). Pest Manag Sci. vol.57, #1: pp.46–56.
80. Pline W.A., Price A.J., Wilcut J.W., Edmisten K.L., Wells R. 2001 Absorption and translocation of glyphosate in glyphosate-resistant cotton as influenced by application method and growth stage. Weed Science, vol.49: pp.460–467.
81. Yamada T, Ishige T, Shiota N, Inui H, Ohkawa H, Ohkawa Y. 2002 Enhancement of metabolizing herbicides in young tubers of transgenic potato plants with the rat CYP1A1 gene. Theor Appl Genet. vol.105, #4: pp.515–520.
82. Bode M, Stobe P, Thiede B, Schuphan I, Schmidt B. 2004 Biotransformation of atrazine in transgenic tobacco cell culture expressing human P450. Pest Manag Sci. vol.60, #1: pp.49–58.
83. Birnbaum LS, Fenton SE. 2003 Cancer and developmental exposure to endocrine disruptors. Environ Health Perspect vol.111, #4: pp.389–394.
84. Cooper RL, Goldman JM, Stoker TE. 1999 Neuroendocrine and reproductive effects of contemporary-use pesticides. Toxicol Ind Health. vol.15, #1–2: pp.26–36.
85. Bevan M, Shufflebottom D, Edwards K, Jefferson R, Schuch W. 1989 Tissue- and cell-specific activity of a phenylalanine ammonia-lyase promoter in transgenic plants. EMBO J. vol.8, #7: pp.1899–1906.
86. Sevenier R, van der Meer IM, Bino R, Koops AJ 2002. Increased production of nutriments by genetically engineered crops. J Am Coll Nutr. vol.21, #3 Suppl: pp.199S–204S.
87. Stobiecki M, Matysiak-Kata I, Franski R, Skala J, Szopa J. 2003 Monitoring changes in anthocyanin and steroid alkaloid glycoside content in lines of transgenic potato plants using liquid chromatography/mass spectrometry. Phytochemistry. Vol.62, #6: pp.959–969.
88. Burtin D, Michael AJ 1997. Overexpression of arginine decarboxylase in transgenic plants. Biochem J. vol.325, Pt 2: pp.331–337.
89. Bassie L, Noury M, Lepri O, Lahaye T, Christou P, Capell T. 2000 Promoter strength influences polyamine metabolism and morphogenic capacity in transgenic rice tissues expressing the oat adc cDNA constitutively. Transgenic Res. Feb;9(1):33–42.
90. Цырлин В.А., Кузьменко Н.В., Плисс М.Г 2001. Роль имидазолиновых рецепторов
в центральной регуляции кровообращения (история и современное
состояние вопроса) Вестник Аритмологии, № 21, , сс.92–97.
91. Nicoletti R, Venza I, Ceci G, Visalli M, Teti D, Reibaldi A. 2003 Vitreous polyamines spermidine, putrescine, and spermine in human proliferative disorders of the retina. Br J Ophthalmol. vol.87, #8: pp.1038–1042.
92. Fraser PD, Romer S, Shipton CA, Mills PB, Kiano JW, Misawa N, Drake RG, Schuch W, Bramley PM. 2002 Evaluation of transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in a fruit-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. vol.99, #2: pp.1092–1097.
93. Bartoszewski G., Malepszy S., Smigocki A.C., Niemirowicz K. 1998 Preliminary characteristics of transgenic tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) plants with the isopentil transferase gene. TEKTRAN, Agricultural Research Service, http://www.nal.usda.gov/ttic/tektran/data/000009/46/0000094647.html
94. Haberer G., Kieber J.J. 2002 Cytokinins.. New Insights into a Classic Phytohormone. Plant Physiol, February, Vol. 128, #2, pp.354–362.
94а. Redig P, Schmulling T, Van Onckelen H. 1996 Analysis of Cytokinin Metabolism in ipt Transgenic Tobacco by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. Plant Physiol. vol.112, #1: pp.141–148.
95. Mookerjee BK, Ballard J, Bentzel CJ, Allen JC, Jung CY. 1979 Effects of plant cytokinins on human lymphocyte transformation. J Reticuloendothel Soc. vol.25, #3: pp.299–314.
96. Vermeulen K, Strnad M, Krystof V, Havlicek L, Van der Aa A, Lenjou M, Nijs G, Rodrigus I, Stockman B, van Onckelen H, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. 2002 Antiproliferative effect of plant cytokinin analogues with an inhibitory activity on cyclin-dependent kinases. Leukemia. vol.16, #3: pp.299–305.
97. Vesely DL, Hudson JL, Pipkin JL Jr, Pack LD, Meiners SE. 1985 Plant growth-promoting hormones activate mammalian guanylate cyclase activity. Endocrinology. vol.116, #5: pp.1887–1892.
98. Heo HJ, Hong SC, Cho HY, Hong B, Kim HK, Kim EK, Shin DH. 2002 Inhibitory effect of zeatin, isolated from Fiatoua villosa, on acetylcholinesterase activity from PC12 cells. Mol Cells. vol.13, #1: #113–117.
99. Froldi G, Gallo U, Ragazzi E, Caparrotta L. 1999 6-Benzylaminopurine: a plant derived cytokinin inducing positive inotropism by P2-purinoceptors. Planta Med. vol.65, #3: pp.245–249.
100. Anand A, Schmelz EA, Muthukrishnan S. 2003 Development of a lesion-mimic phenotype in a transgenic wheat line overexpressing genes for pathogenesis-related (PR) proteins is dependent on salicylic acid concentration. Mol Plant Microbe Interact. vol.16(10):916–25.
101. Ho MW. Pharmageddon. Science in Society, 2003, 17 , 23–4.
102. McKie R., . GM corn set to stop man spreading his seed. Guardian Anlimited. September 9, 2001. (http://www.guardian.co.uk/gmdebate/Story/0,2763,549002,00.html)
103. Lin CT, Lin WH, Lyu YL, Whang-Peng J. 2001 Inverted repeats as genetic elements for promoting DNA inverted duplication: implications in gene amplification Nucleic Acids Res. vol.29, #17: pp.3529–3538
104. Phipps RH, Deaville ER, Maddison BC. 2003 Detection of transgenic and endogenous plant DNA in rumen fluid, duodenal digesta, milk, blood, and feces of lactating dairy cows. J Dairy Sci. vol.86, #12: pp.4070–4078.
105. Chowdhury EH, Mikami O, Nakajima Y, Hino A, Kuribara H, Suga K, Hanazumi M, Yomemochi C. 2003 Detection of genetically modified maize DNA fragments in the intestinal contents of pigs fed StarLink CBH351. Vet Hum Toxicol. vol.45, #2: pp.95–96.
106. Khan MS, Maliga P. 1999 Fluorescent antibiotic resistance marker for tracking plastid transformation in higher plants. Nat Biotechnol. vol.17, #9: #910–915.
107. Конов А.Л. 2002 Биотехнология и “горизонтальный” перенос генов: Можно ли съев ГМ-продукты, приобрести устойчивость к антибиотикам?
Экология и жизнь. №2..сс.66–68.
108. Perna NT, Plunkett G 3rd, Burland V, Mau B, Glasner JD, Rose DJ, Mayhew GF, Evans PS, Gregor J, Kirkpatrick HA, Posfai G, Hackett J, Klink S, Boutin A, Shao Y, Miller L, Grotbeck EJ, Davis NW, Lim A, Dimalanta ET, Potamousis KD, Apodaca J, Anantharaman TS, Lin J, Yen G, Schwartz DC, Welch RA, Blattner FR 2001. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. vol.409, #6819: pp.529–533.
109. Bekal S, Brousseau R, Masson L, Prefontaine G, Fairbrother J, Harel J 2003. Rapid identification of Escherichia coli pathotypes by virulence gene detection with DNA microarrays. J Clin Microbiol. vol.41, #5: pp.2113–2125.
110. Blahova J, Kralikova K, Krcmery V Sr, Kubonova K, Vaculikova A, Mikovicova A, Klokocnikova L, Hanzen J, Jezek P. 2001 Transferable antibiotic resistance in multiresistant nosocomial Acinetobacter baumannii strains from seven clinics in the Slovak and Czech Republics. J Chemother. vol.13, #2: pp.143–147.
111. Smalla K, Heuer H, Gotz A, Niemeyer D, Krogerrecklenfort E, Tietze E. 2000 Exogenous isolation of antibiotic resistance plasmids from piggery manure slurries reveals a high prevalence and diversity of IncQ-like plasmids. Appl Environ Microbiol. vol.66, #11: pp.4854–4862.
112. Jacob D, Lewin A, Meister B, Appel B. 2002 Plant-specific promoter sequences carry elements that are recognised by the eubacterial transcription machinery. Transgenic Res. vol.11, #3: pp.291–303.
113. Ho MW, Ryan A and Cummins J. 2000 Hazards of transgenic plants with the cauliflower mosaic viral promoter. Microbial Ecology in Health and Disease: vol.12: pp.6–11.
114. Ho MW, Cummins J. and Ryan A. Cauliflower Transgenic Instability. ISIS Reprints, ISIS Publications 2002: www.i-sis.org.uk
115. Jennings JC, Kolwyck DC, Kays SB, Whetsell AJ, Surber JB, Cromwell GL, Lirette RP, Glenn KC. 2003 Determining whether transgenic and endogenous plant DNA and transgenic protein are detectable in muscle from swine fed Roundup Ready soybean meal. J Anim Sci. vol.81#6: pp.1447–1455.
115а. The United Kingdom Parliament. 2003 The Commons Hansard Written Answers text for Wednesday 25 June 2003, Volume No.407,Part No.416, http://www.parliament.the-stationery-office.co.uk/pa/cm200203/cmhansrd//vo030625/index/30625-x.htm
116. Nap J.P., Metz P.L.J., Escaler M, Conner A.J. 2003 The release of genetically modified crops into the Environment. Part I. Overview of current status and regulations. The Plant Journal The release of genetically modified crops
into the Environment. Part II. Overview of ecological risk assessment. The Plant Journal vol.33, #1, pp.1–18.
117. Conner A.J., Glare T.R., Nap J.-P. 2003 The release of genetically modified crops into the Environment. Part II. Overview of ecological risk assessment. The Plant Journal vol.33, #1, pp.19–46.

Обсуждения статьи:

Сообщений нет!